低魚(yú)粉飼料中添加酶解豆粕對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能和 抗脅迫機(jī)能的影響
摘要:為研究在養(yǎng)殖過(guò)程中降低魚(yú)粉用量的同時(shí)保持凡納濱對(duì)蝦良好的生長(zhǎng)性能和抗逆能力,實(shí)驗(yàn)在含10%魚(yú)粉的基礎(chǔ)飼料中,分別添加酶解豆粕(PSM) 0%(A)、2.5%(B)、 3.5%(C)、4.5%(D)、5.5%(E)制成5組等氮等能飼料,分別投喂初始體質(zhì)量為(0.45±0.02) g 的凡納濱對(duì)蝦幼蝦8周,檢測(cè)對(duì)蝦生長(zhǎng)性能及抗脅迫機(jī)能。結(jié)果顯示,8周養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,各實(shí)驗(yàn)組對(duì)蝦的終末體質(zhì)量為14.65~15.38 g/尾,各組間對(duì)蝦終末均重、成活率和飼料系數(shù)指標(biāo)均無(wú)顯著性差異;A組對(duì)蝦肌肉粗蛋白質(zhì)含量顯著低于其他各實(shí)驗(yàn)組;C組、 D組和E組對(duì)蝦肌肉粗脂肪含量顯著高于A組;各組間灰分和水分均無(wú)顯著性差異;D組 和E組對(duì)蝦肝胰腺蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、血清溶菌酶和血清總超氧化物歧化酶活性 (T-SOD)均顯著高于A組;A組對(duì)蝦血清丙二醛(MDA)含量顯著高于D組和E組。人工急性 感染高劑量副溶血性弧菌的脅迫實(shí)驗(yàn)中,A組對(duì)蝦在弧菌感染48和60 h時(shí)的累積死亡率均顯著高于D組對(duì)蝦同期的累積死亡率;低劑量副溶血性弧菌人工急性感染后,在凡納濱對(duì)蝦鰓組織中檢測(cè)Toll受體、免疫缺陷(IMD)和溶菌酶3種免疫相關(guān)基因的表達(dá)量,結(jié)果顯示,對(duì)蝦Toll受體、IMD和溶菌酶mRNA表達(dá)量最大峰值分別出現(xiàn)在添加酶解豆粕的 C組、B組和D組,峰值出現(xiàn)時(shí)刻分別為感染后24、42和24 h。研究表明,含10%魚(yú)粉的 飼料中添加0%~5.5%酶解豆粕對(duì)凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能改善效果不顯著,酶解豆粕會(huì)顯著提高凡納濱對(duì)蝦肌肉粗蛋白質(zhì)含量和粗脂肪含量;顯著降低對(duì)蝦血清丙二醛含量;同時(shí)也會(huì)顯著改變凡納濱對(duì)蝦對(duì)弧菌的抵抗力及其免疫相關(guān)基因的時(shí)空表達(dá),酶解豆粕添加量達(dá)到4.5%時(shí)可使養(yǎng)殖的凡納濱對(duì)蝦獲得最佳的抗弧菌能力。
凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)因其具有生長(zhǎng)速度快,鹽度適應(yīng)廣等優(yōu)點(diǎn),成為我國(guó)養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的經(jīng)濟(jì)蝦類。凡納濱對(duì)蝦對(duì)飼料中蛋白質(zhì)的需求量通常為35%~42%,其中魚(yú)粉一直是對(duì)蝦飼料中重要的蛋白質(zhì)來(lái)源,也是影響飼料配方成本的重要因素。實(shí)際生產(chǎn)中魚(yú)粉用量一般不低于20%,飼料中魚(yú)粉用量的降低,會(huì)造成對(duì)蝦生長(zhǎng)緩慢、抗病力降低等問(wèn)題。但是隨著資源和環(huán)境壓力的增大,降低偏肉食性水產(chǎn)動(dòng)物飼料配方中魚(yú)粉的用量,以豆粕等植物蛋白部分替代魚(yú)粉是當(dāng)前水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)飼料研究的重要內(nèi)容。然而水產(chǎn)動(dòng)物飼料配方中過(guò)量使用豆粕通常會(huì)因植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子的存在而影響飼料的適口性、養(yǎng)殖動(dòng)物的消化機(jī)能、生長(zhǎng)性能和抗脅迫機(jī)能。有研究發(fā)現(xiàn),南方鲇(Silurus meridionalis)對(duì)蛋白質(zhì)、脂肪和能量的消化率隨著大豆蛋白對(duì)魚(yú)粉替代率的提高而逐步下降,當(dāng)替代量達(dá)到65%時(shí),其消化率顯著低于其余各組。飼料中豆粕蛋白替代魚(yú)粉蛋白的水平超過(guò)40%時(shí),會(huì)顯著降低軍曹魚(yú)(Rachycentron canadum)的生長(zhǎng)和飼料利用率。目前通過(guò)發(fā)酵或酶解方式是去除豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子、提高配方中豆粕使用量的重要措施。通過(guò)酶解技術(shù)得到的大豆多肽,相比于普通豆粕具有營(yíng)養(yǎng)全面、易消化吸收等諸多特性,尤其是在抗氧化、調(diào)節(jié)非特異性免疫等方面具有很好的效果。對(duì)舌齒鱸(Dicentrarchus labrax)飼料中魚(yú)粉替代的研究表明,普通去皮豆粕可以替代飼料中25%的魚(yú)粉,而經(jīng)酶解處理的豆粕則能夠替代50%的魚(yú)粉。
本實(shí)驗(yàn)擬在含10%魚(yú)粉的基礎(chǔ)飼料中,設(shè)計(jì)5個(gè)梯度的酶解豆粕添加量,制成5組等氮等能的實(shí)驗(yàn)飼料分別飼養(yǎng)凡納濱對(duì)蝦幼蝦,以此評(píng)估低魚(yú)粉飼料中使用酶解豆粕對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)、體組成、消化能力、抗脅迫能力以及免疫基因表達(dá)等方面的影響,以期為低魚(yú)粉飼料中酶解豆粕的合理使用提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 飼料的制備
本實(shí)驗(yàn)所用酶解豆粕由江蘇泰州福益生物科技股份有限公司提供,通過(guò)蛋白酶和非淀粉多糖酶定位酶解普通豆粕,所得酶解豆粕粗蛋白含量為48%±1%,肽分子量分布由江南大學(xué)分析測(cè)試中心檢測(cè)(GB/T 22492-2008)(表1)。實(shí)驗(yàn)所用普通豆粕粗蛋白含量為46%±1%,普通豆粕中肽分子量范圍<1000的比例一般在50%左右。
制作5種不同酶解豆粕添加量的等氮等能飼料(表2)。所有原料經(jīng)破碎后,過(guò)80目篩網(wǎng),按照飼料配方比例稱重并采用四分法逐級(jí)擴(kuò)散混勻,依次加入油脂和水搓勻,經(jīng)絞肉機(jī)擠壓并制粒,90℃熟化20min,于陰涼通風(fēng)處晾干,將成品飼料破碎成適合養(yǎng)殖期間各生長(zhǎng)階段對(duì)蝦采食的飼料粒徑,−20℃冰箱保存。
1.2 養(yǎng)殖管理
實(shí)驗(yàn)用凡納濱對(duì)蝦蝦苗購(gòu)自上海聯(lián)旺水產(chǎn)科技有限公司(養(yǎng)殖水體鹽度為5),蝦苗暫養(yǎng)于水泥池內(nèi),逐步淡化,直至水體鹽度降至0。淡化期間,投喂商品蝦片,蝦苗暫養(yǎng)30d,挑選規(guī)格整齊、健康的對(duì)蝦1000尾,平均分成5組,每組設(shè)4個(gè)重復(fù),初始均重為(0.45±0.02)g,隨機(jī)分配到同一水泥池(5.0m×11.0m×1.2m)中的20個(gè)網(wǎng)箱(1.0m×1.0m×1.2m)內(nèi),每個(gè)網(wǎng)箱內(nèi)投放50尾幼蝦。每日投喂4次,分別在5:30、10:30、16:30和22:30等4個(gè)時(shí)間點(diǎn)投喂,日投喂量約占蝦體質(zhì)量的5%~8%,并根據(jù)天氣、攝食情況以及生長(zhǎng)階段進(jìn)行調(diào)整。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)持續(xù)8周,養(yǎng)殖期間每周換水2次,進(jìn)水經(jīng)200目濾水袋過(guò)濾,水體透明度維持在20~40cm。養(yǎng)殖期間保持連續(xù)充氣,水體溶氧量控制在6mg/L以上,pH為7.8~8.5,氨氮濃度低于0.2mg/L,水溫為(30±2)℃,水體鹽度為0。
1.3 樣品采集
生長(zhǎng)性能測(cè)定 養(yǎng)殖8周,停止投喂24h后,逐個(gè)網(wǎng)箱稱重、計(jì)數(shù)。每個(gè)網(wǎng)箱隨機(jī)取凡納濱對(duì)蝦8尾,用1mL一次性無(wú)菌注射器于對(duì)蝦圍心腔處取血淋巴后置于1.5mL離心管中,放置于冰盒保存;在托盤(pán)上快速解剖對(duì)蝦,取肝胰腺和肌肉于冰盒保存,并隨機(jī)取3尾對(duì)蝦的鰓迅速置于盛有RNA保存液(北京天根公司)的1.5mL的離心管中,血淋巴經(jīng)4℃、10000r/min離心10min取上清液,所有樣品于−80℃冰箱保存。各類生長(zhǎng)指標(biāo)計(jì)算方法如下:
成活率(survivalrate,SR,%)=Nt/N0×100%
飼料系數(shù)(feed conversion ratio,F(xiàn)CR)=Wf/(Wt-W0)
特定生長(zhǎng)率(specific growth rate,SGR,%/d)=(lnWt/Nt-lnW0/N0)/t×100%式中,Nt為終末尾數(shù),N0為初始尾數(shù),Wf為每個(gè)網(wǎng)箱所投飼料總重(g);Wt和W0分別為實(shí)驗(yàn)結(jié)束和開(kāi)始時(shí)每個(gè)網(wǎng)箱蝦總重(g);t為實(shí)驗(yàn)天數(shù)(d)。
高濃度副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)人工急性感染實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)
所用副溶血性弧菌菌株取自上海海洋大學(xué)病原庫(kù)。8周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,每組隨機(jī)撈取30尾對(duì)蝦,分3個(gè)平行,置于15個(gè)網(wǎng)箱(50cm×30cm×80cm)中,每個(gè)網(wǎng)箱10尾。菌種需經(jīng)蝦體活化后于硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(TCBS)分離培養(yǎng),預(yù)實(shí)驗(yàn)需注射活化菌液于同規(guī)格蝦體中,觀察96h內(nèi)凡納濱對(duì)蝦的死亡情況,篩選出最適半致死濃度。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,每尾蝦腹部注射35μL6.25×107CFU/mL經(jīng)活化培養(yǎng)后分離的副溶血性弧菌菌液,對(duì)照組取同規(guī)格對(duì)蝦注射無(wú)菌生理鹽水。實(shí)驗(yàn)期間持續(xù)曝氣,水溫控制在(30±1)℃。注射菌液后連續(xù)觀察網(wǎng)箱中各飼料組對(duì)蝦的死亡情況,在24、36、48、72、84和96h時(shí)分別統(tǒng)計(jì)各網(wǎng)箱的累積死亡率。
低濃度副溶血性弧菌人工急性感染實(shí)驗(yàn)
8周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,每組隨機(jī)撈取75尾凡納濱對(duì)蝦,分成3個(gè)平行,放置于15個(gè)(50cm×30cm×80cm)網(wǎng)箱中,根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,活菌液用4%甲醛溶液滅活1h,4℃、3000r/min離心10min,取底部離心物用生理鹽水反復(fù)沖洗、離心。每尾蝦腹部注射25μL1.25×106CFU/mL經(jīng)滅活的副溶血性弧菌菌液,對(duì)照組取同規(guī)格的對(duì)蝦注射無(wú)菌生理鹽水。養(yǎng)殖水體溫度為(30±1)℃,水體鹽度為0,24h持續(xù)曝氣。分別在0、6、12、18、24、30、36、42和48h從每個(gè)網(wǎng)箱取3尾對(duì)蝦,采集鰓組織并分別存放于裝有RNA保存液(北京天根公司)的離心管中,−80℃保存,用于測(cè)定鰓組織中免疫相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量。
1.4 樣品檢測(cè)分析
飼料及凡納濱對(duì)蝦肌肉常規(guī)檢測(cè)分析 飼料和肌肉中的水分含量采用105℃烘箱干燥恒重法檢測(cè)(GB/T 6435—2014);粗脂肪采用氯仿-甲醇法檢測(cè)(GB/T 6433—2006);灰分采用550℃馬弗爐灼燒法檢測(cè)(GB/T 6438—2007);粗蛋白質(zhì)采用凱氏定氮儀(KjeltecTM 2300,瑞典)檢測(cè)(GB/T 6432—2018)。
血清及肝胰腺生化指標(biāo) 對(duì)蝦肝胰腺用冰浴勻漿處理,稀釋成相應(yīng)的組織勻漿液,勻漿液于3000r/min、4℃條件下離心10min,取上清液。肝胰腺蛋白酶活性采用Folin-酚法、脂肪酶活性采用對(duì)硝基苯酚法、淀粉酶活性采用淀粉-碘比色法(南京建成試劑盒)。離心后的血清經(jīng)生理鹽水稀釋后,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)(南京建成生物工程研究所)測(cè)定各抗氧化指標(biāo)。
低濃度副溶血性弧菌感染后凡納濱對(duì)蝦免疫相關(guān)基因表達(dá)量檢測(cè) 按照Trizol試劑盒(TaKaRa)說(shuō)明書(shū)從對(duì)蝦鰓組織中提取總RNA。用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定其OD260nm和OD280mm比值,并用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。將提取的總RNA用TaKaRa公司PrimeScript@RT reagent Kit with gDNA Eraser(Per-fect Real Time)試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA,−20℃保存。
參照凡納濱對(duì)蝦Toll受體mRNA(GenBank:DQ923424.1)、溶菌酶mRNA(GenBank:AYl70126.2)、IMDmRNA(GenBank:FJ592176.1)和β-actin基因(GenBank:AF300705)設(shè)計(jì)熒光定量引物,所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表3)。
采用RT-PCR儀(Bio-rad公司)按照SYBR@PremixExTaqTM(TliRNaseHPlus)試劑盒(TaKaRa公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè),RT-PCR程序?yàn)?5℃、30s預(yù)變性;95℃、10s,60℃、30s,共39個(gè)循環(huán);反應(yīng)完成后溫度由65℃上升到90℃,測(cè)定熔解曲線檢測(cè)反應(yīng)特異性。結(jié)果采用相對(duì)表達(dá)量的形式,根據(jù)2−ΔΔCt計(jì)算法進(jìn)行計(jì)算。
1.5 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析
實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)的方式表示,數(shù)據(jù)使用SPSS25.0分析軟件中的單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan氏多重比較法進(jìn)行差異顯著性分析,P<0.05則表示為差異顯著。
2 結(jié)果
2.1 飼料中添加酶解豆粕對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響
8周養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,各實(shí)驗(yàn)組凡納濱對(duì)蝦成活率均在97%以上;各組對(duì)蝦終末均重為14.65~15.38g/尾;飼料系數(shù)呈現(xiàn)出先下降后升高的趨勢(shì),A組最高;特定生長(zhǎng)率呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì),最低組為A組;各組間均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表4)。
2.2 飼料中添加酶解豆粕對(duì)凡納濱對(duì)蝦肌肉常規(guī)組成的影響
凡納濱對(duì)蝦肌肉中粗蛋白質(zhì)含量,A組顯著低于其他各實(shí)驗(yàn)組(P<0.05),E組最高;對(duì)蝦肌肉中粗脂肪含量隨著酶解豆粕添加量的增加,整體呈現(xiàn)升高的趨勢(shì),A組顯著低于C組、D組和E組(P
2.3 飼料中添加酶解豆粕對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺消化酶的影響
對(duì)蝦肝胰腺中蛋白酶活性隨飼料中酶解豆粕添加量的增加呈升高的趨勢(shì),D組和E組顯著高于A組和B組(P<0.05);B組、D組和E組對(duì)蝦的淀粉酶活性顯著高于A組(P<0.05);對(duì)蝦的脂肪酶活性隨飼料中酶解豆粕添加量的增加整體呈現(xiàn)出升高的趨勢(shì),D組和E組顯著高于A組(P<0.05)(表6)。
2.4 飼料中添加酶解豆粕對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清溶菌酶和抗氧化能力的影響
隨飼料中酶解豆粕添加量的增多,各組凡納濱對(duì)蝦血清溶菌酶活性呈先升后降的變化趨勢(shì),A組最低,D組最高且顯著高于其他各組(P<0.05);血清中T-SOD活性隨飼料中酶解豆粕添加量的增多而增高,E組最高,且顯著高于其他各組(P<0.05);血清丙二醛含量隨飼料中酶解豆粕添加量的增多呈現(xiàn)先降后升的變化趨勢(shì),A組最高,且顯著高于其他各組(P<0.05)(表7)。
2.5 飼料中添加酶解豆粕對(duì)感染高劑量副溶血性弧菌的凡納濱對(duì)蝦成活率的影響
在對(duì)蝦腹部注射35μL6.25×107CFU/mL經(jīng)活化培養(yǎng)后分離的副溶血性弧菌,各組對(duì)蝦96h內(nèi)的累積死亡率顯示,A組對(duì)蝦在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的累積死亡率均高于其他各組,D組對(duì)蝦在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的累積死亡率均低于其他各組,且在48和60h時(shí)顯著低于A組(P<0.05)(圖1)。
2.6 飼料中添加酶解豆粕對(duì)凡納濱對(duì)蝦急性感染副溶血性弧菌后免疫相關(guān)基因表達(dá)量的影響
凡納濱對(duì)蝦人工急性感染副溶血性弧菌后對(duì)蝦Toll受體mRNA表達(dá)量最大峰值出現(xiàn)在24h、C組,A組于42h出現(xiàn)峰值,B組、C組和E組峰值均大于A組(P<0.05)(表8)。對(duì)蝦IMD mRNA表達(dá)量最大峰值出現(xiàn)在42h、B組,飼料中添加酶解豆粕的各實(shí)驗(yàn)組峰值均大于A組,其中在18h時(shí)對(duì)IMD mRNA表達(dá)量影響最顯著(P<0.05)(表9)。對(duì)蝦溶菌酶mRNA表達(dá)量最大峰值出現(xiàn)在24h、D組,其中D組和E組峰值均大于A組,飼料中添加酶解豆粕在12h時(shí)對(duì)溶菌酶mRNA表達(dá)量影響最顯著(P<0.05)(表10)。
3 討論
3.1 飼料中添加酶解豆粕對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響
研究發(fā)現(xiàn),相對(duì)于完整的蛋白質(zhì),動(dòng)物的腸道組織細(xì)胞對(duì)肽具有更高的吸收效率。經(jīng)測(cè)定,實(shí)驗(yàn)所用酶解豆粕中相對(duì)分子量<1000的肽含量占72.83%。通過(guò)對(duì)蛋白水解產(chǎn)物的研究表明,去除蛋白水解物中的小分子,會(huì)降低飼料的利用率,從而發(fā)現(xiàn)蛋白水解所產(chǎn)生的小分子復(fù)合物對(duì)于水生動(dòng)物的生長(zhǎng)至關(guān)重要。有研究表明,分子量為1000~3000的水解大豆肽能夠有效促進(jìn)真鯛(Pagrus major)和牙鲆(Paralichthys olivaceus)的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著酶解豆粕添加量的增加,雖然對(duì)蝦的終末均重和特定增長(zhǎng)率都有一定的增長(zhǎng)趨勢(shì),飼料系數(shù)也有一定程度的降低,但是添加5.5%以內(nèi)的酶解豆粕對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的改善效果并不顯著,分析原因可能與飼料中小分子肽的總含量較少有部分關(guān)系。有研究表明,飼料中大豆多肽添加量低于20%時(shí),對(duì)牙鲆幼魚(yú)的生長(zhǎng)性能和飼料效率并沒(méi)有產(chǎn)生顯著的影響。不同餅粕蛋白酶解產(chǎn)物肽的種類和分子組成不同,對(duì)異育銀鯽(Carassiusauratus gibelio)產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)效果也不同,飼料中小分子肽比例越大,飼養(yǎng)的魚(yú)類生產(chǎn)性能表現(xiàn)效果越好。
隨著酶解豆粕添加量的增加,凡納濱對(duì)蝦肌肉中粗蛋白含量相較于對(duì)照組均有顯著的提高。一方面可能與飼料中普通豆粕含量的降低有部分關(guān)系,有研究表明,水生動(dòng)物的總蛋白水平會(huì)隨著飼料中豆粕含量的增加而降低;另一方面可能是酶解豆粕對(duì)凡納濱對(duì)蝦的蛋白質(zhì)沉積具有促進(jìn)作用,相較于大豆蛋白,動(dòng)物體對(duì)大豆肽的吸收更加高效且迅速,減少了動(dòng)物在吸收過(guò)程中的能量消耗,從而促進(jìn)了動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)的沉積。研究發(fā)現(xiàn),建鯉(Cyprinus carpio var.Jian)飼料中的魚(yú)粉或植物蛋白被等量蛋白肽替代后,可促進(jìn)魚(yú)體粗蛋白質(zhì)沉積,并降低了內(nèi)臟重量,優(yōu)化了建鯉形體指標(biāo)。而且隨著飼料中豆粕含量的增加,非淀粉多糖對(duì)水生動(dòng)物的影響也會(huì)更加明顯。非淀粉多糖在體外和體內(nèi)均可降低脂肪酶等的活性,影響水生動(dòng)物對(duì)外源脂肪的吸收轉(zhuǎn)運(yùn),而此次實(shí)驗(yàn)中各實(shí)驗(yàn)組粗脂肪含量隨酶解豆粕使用量的增加呈現(xiàn)顯著上升的趨勢(shì),分析原因可能是本實(shí)驗(yàn)所用酶解豆粕是用蛋白酶和非淀粉多糖酶復(fù)合酶解,一定程度上降低了豆粕中所含的非淀粉多糖阻礙對(duì)蝦對(duì)外源脂肪吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的不利影響。各組對(duì)蝦肌肉水分和灰分沒(méi)有顯著性差異,說(shuō)明此次實(shí)驗(yàn)中酶解豆粕并未對(duì)肌肉中其他成分產(chǎn)生影響。
酶解豆粕添加量達(dá)到4.5%以上時(shí)對(duì)對(duì)蝦的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性均有顯著提高,這也與以往的許多研究報(bào)道相吻合。豆粕過(guò)量替代魚(yú)粉會(huì)對(duì)鯉(Cyprinus carpio)腸道產(chǎn)生損傷同時(shí)也會(huì)降低肝胰臟蛋白酶的活性。從尼羅羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus)體內(nèi)也檢測(cè)到,豆粕對(duì)消化蛋白酶具有很高的抑制作用。而對(duì)蝦對(duì)食物的消化吸收能力很大程度上依賴于消化酶的活性。豆粕中胰蛋白酶抑制因子是影響水生動(dòng)物對(duì)大豆蛋白消化吸收的主要抗?fàn)I養(yǎng)因子,動(dòng)物體內(nèi)胰蛋白酶會(huì)隨著外部的胰蛋白酶抑制因子的進(jìn)入反應(yīng)形成難以被動(dòng)物體消化吸收的復(fù)合物,從而失去應(yīng)有的活性。通常大豆經(jīng)酶處理后,消化率會(huì)得到相應(yīng)的改善,這種酶處理方法在魚(yú)類攝食前就可引發(fā)蛋白質(zhì)降解。有研究顯示,飼料中大豆水解蛋白替代15%~70%的魚(yú)粉時(shí),能夠顯著提高星斑川鰈(Platichthysstellatus)幼魚(yú)的胰蛋白酶活性。
3.2 飼料中添加酶解豆粕對(duì)凡納濱對(duì)蝦抗脅迫機(jī)能的影響
機(jī)體抗氧化能力是評(píng)價(jià)水產(chǎn)動(dòng)物健康狀況的一個(gè)重要指標(biāo)。自由基是一種具有較強(qiáng)氧化作用的物質(zhì),當(dāng)機(jī)體應(yīng)激產(chǎn)生過(guò)多自由基時(shí),會(huì)氧化組織從而對(duì)機(jī)體造成損傷。因此機(jī)體需要一套健全有效的抗氧化防御體系來(lái)調(diào)節(jié)體內(nèi)自由基含量,保持機(jī)體健康。
蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的小分子肽,在機(jī)體內(nèi)具有較強(qiáng)的抗氧化活性。研究顯示,酶解大豆蛋白具有較高的還原能力、較高的乳化液抗氧化能力和較強(qiáng)的清除自由基能力,而其抑制β-胡蘿卜素漂白的能力與合成抗氧化劑能力相當(dāng),分子量小于10000的酶解大豆蛋白相較于普通大豆蛋白顯示出更高的抗氧化活性。有研究指出,從各種蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物中提取到的生物活性肽,可通過(guò)上調(diào)抗氧化酶活性,發(fā)揮出其潛在的抗氧化作用。飼料中利用大豆蛋白水解物替代魚(yú)粉的實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)替代量達(dá)到15%~100%時(shí)會(huì)顯著增強(qiáng)星斑川鰈幼魚(yú)的SOD活性,替代量達(dá)到30%~100%時(shí),實(shí)驗(yàn)組MDA含量顯著低于對(duì)照組。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,低魚(yú)粉飼料中酶解豆粕含量對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清溶菌酶、T-SOD活性和MDA含量具有顯著影響。已有研究表明,利用食品級(jí)豬胰腺蛋白水解制劑(CorolasePP)酶解大豆粕,通過(guò)ABTS和ORAC方法檢測(cè)大豆肽水解物的抗氧化活性,結(jié)果顯示酶解大豆得到的大豆肽具有較高的抗氧化活性。在飼料中添加水解蛋白產(chǎn)物,會(huì)促使牙鲆體內(nèi)溶菌酶和SOD活性顯著增加。酶解大豆蛋白得到的大豆多肽可提高對(duì)動(dòng)物機(jī)體內(nèi)自由基的清除能力,在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抗氧化和促進(jìn)礦物元素吸收等方面也發(fā)揮著重要作用。相較于普通大豆蛋白,大豆肽增加了清除自由基能力,提高了機(jī)體總抗氧化活性和還原能力。
凡納濱對(duì)蝦的免疫機(jī)能主要是依靠非特異性免疫起作用,而活體攻毒是指在一定劑量致病菌的攻擊下直觀反映機(jī)體綜合免疫機(jī)能的實(shí)驗(yàn)手段。通過(guò)研究副溶血性弧菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦生理生化指標(biāo)的影響表明,副溶血性弧菌的感染會(huì)破壞蝦體的免疫系統(tǒng),導(dǎo)致免疫機(jī)能損壞。有研究表明,在飼料中添加5%~15%的水解蛋白,對(duì)花鱸(Lateolabrax japonicus)的非特異性免疫反應(yīng)有所改善。在低魚(yú)粉飼料中添加蛋白水解物飼喂牙鲆幼魚(yú)的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),飼料中添加蛋白水解產(chǎn)物能提高魚(yú)體的先天免疫能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著感染時(shí)間的增加,飼料中添加酶解豆粕對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫力的改善效果明顯,對(duì)照組在各時(shí)間點(diǎn)累積死亡率均比其他實(shí)驗(yàn)組同期累積死亡率高。已有研究報(bào)道,在大豆水解物中可分離鑒定出抗菌肽,其對(duì)溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和副溶血性弧菌的生長(zhǎng)有抑制作用,可提高對(duì)蝦的存活率。通過(guò)同源序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),大豆肽中含有一種能夠刺激巨噬細(xì)胞和多核白細(xì)胞吞噬作用的物質(zhì),通過(guò)刺激細(xì)胞吞噬作用,提高動(dòng)物機(jī)體的免疫力。
營(yíng)養(yǎng)控制是調(diào)節(jié)非特異性免疫反應(yīng)并提高抗病性的有效方法。Toll受體在介導(dǎo)蝦體啟動(dòng)天然免疫并釋放免疫因子的機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。當(dāng)對(duì)蝦受病原菌入侵時(shí),Toll受體將異物入侵的信號(hào)從胞外傳遞到胞內(nèi),并引起胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng),介導(dǎo)細(xì)胞啟動(dòng)先天免疫反應(yīng)。IMD通路是一個(gè)重要免疫識(shí)別信號(hào)傳導(dǎo)通路,革蘭氏陰性細(xì)菌和桿狀陽(yáng)性細(xì)菌能通過(guò)跨膜蛋白PGRP-LC激活I(lǐng)MD信號(hào)途徑并誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生免疫效應(yīng)因子。溶菌酶作為機(jī)體非特異性免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)的終端效應(yīng)因子,除了能溶解細(xì)菌細(xì)胞壁外,溶解細(xì)胞壁時(shí)釋放的肽聚糖片段還能誘導(dǎo)各種抗菌蛋白包括溶菌酶的合成與分泌。對(duì)蝦進(jìn)行弧菌實(shí)驗(yàn)時(shí),機(jī)體免疫基因表達(dá)水平均升高,Toll受體mRNA的表達(dá)水平在一定程度上可以反映對(duì)蝦對(duì)入侵病原識(shí)別的靈敏性,而機(jī)體清除異物后恢復(fù)至正常狀態(tài)的過(guò)程,在一定程度上反映了機(jī)體的免疫平衡性,提高機(jī)體免疫的靈敏性和平衡性是提高機(jī)體免疫力的根本途徑。此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,對(duì)照組Toll受體mRNA表達(dá)量峰值出現(xiàn)時(shí)間最晚,一定程度上可以反映飼料中添加酶解豆粕有助于提高凡納濱對(duì)蝦對(duì)入侵病原識(shí)別的靈敏性。各基因表達(dá)量最大峰值均出現(xiàn)在添加酶解豆粕的實(shí)驗(yàn)組,表明酶解豆粕對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫基因應(yīng)答具有明顯的促進(jìn)效果。目前的研究表明,營(yíng)養(yǎng)水平會(huì)在一定程度上影響機(jī)體免疫的效果,同時(shí)免疫的效果也決定著機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)素的需求。蛋白質(zhì)水平、維生素水平、微量元素水平、飼料能量水平及免疫多糖等均會(huì)影響對(duì)蝦的免疫機(jī)能和抗菌能力。有報(bào)道顯示,飼料中混合褐藻多糖喂食斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)15d后,可顯著提高斑節(jié)對(duì)蝦對(duì)白斑綜合征病毒(WSSV)的抗病能力。飼料中添加富含核苷酸的酵母提取物使日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeus japonicus)淋巴器官中溶菌酶基因表達(dá)量升高,并增強(qiáng)其抗菌能力。研究表明,中國(guó)明對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)飼料中添加2%VC能上調(diào)鰓組織中Toll受體和NF-κB這2個(gè)免疫基因的表達(dá)量,適量的VC能提高中國(guó)明對(duì)蝦的免疫應(yīng)答能力。
4 結(jié)論
綜上所述,含10%魚(yú)粉的飼料中,酶解豆粕添加量在5.5%以內(nèi)對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的改善效果不顯著。添加量達(dá)到5.5%時(shí)對(duì)凡納濱對(duì)蝦肌肉中粗蛋白和粗脂肪的改善效果最好。添加量達(dá)到4.5%時(shí)對(duì)凡納濱對(duì)蝦消化酶活性、對(duì)蝦機(jī)體抗氧化能力和抗弧菌感染能力的改善效果最好。
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