1.3 料水比對(duì)小肽含量的影響

料水比是影響固體發(fā)酵的重要因素之一。水分含量影響發(fā)酵過(guò)程中微生物的生長(zhǎng)。同時(shí)對(duì)酶的作用影響也比較大。由圖3的結(jié)果可知，小肽的含量隨著料水比的增加，呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)料水比為1：1.2時(shí)，小肽含量最高，為194.90mg／g。當(dāng)料水比過(guò)大時(shí)，小肽含量呈現(xiàn)減少的趨勢(shì)，可能是由于芽孢桿菌這類好氧菌在水分過(guò)多時(shí)生長(zhǎng)受到抑制，從而影響了蛋白質(zhì)降解成小肽。

1.4 發(fā)酵溫度對(duì)小肽含量的影響

溫度是影響酶活的重要因素，酶活的高低，直接影響到豆粕中蛋白質(zhì)酶解成小肽。由圖4的結(jié)果可知，小肽含量隨溫度的升高，先增加后減少，當(dāng)發(fā)酵溫度為40℃時(shí)，小肽含量最高，為192.73mg/g。

1.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)小肽含量的影響

由圖5的結(jié)果可知：隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，小肽的含量先上升后略有下降，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為48h時(shí)，小肽含量最高為182.43mg／g。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)于48h，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，小肽被進(jìn)一步酶解生成游離氨基酸，含量反而出現(xiàn)下降趨勢(shì)，因此酶解時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。

2 豆粕菌酶混合發(fā)酵工藝優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，得到各因素的適宜水平后，設(shè)計(jì)5因素4水平L16(45)的正交試驗(yàn)進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化，試驗(yàn)因素水平編碼表、試驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)施方案和結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果的直觀分析

從表2直觀分析可以看出，極差列中接種量因素的極差值最大，所以得出結(jié)論接種量因素對(duì)小肽含量的影響最大，其次是發(fā)酵溫度、料水比、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)加酶量。發(fā)酵最優(yōu)條件為A1B3C2D4E3，即接種量1.5％，加酶量450u／g，料水比1：1.4，溫度40℃，時(shí)間60h。

2.2 發(fā)酵方案的確定

從正交表中觀察得知最優(yōu)組合為A1B3C3D3E3，與理論最優(yōu)條件A1B3C2D4E3對(duì)比可知發(fā)酵時(shí)間不同，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)小肽含量反而有所下降，因此對(duì)這兩種方案進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得小肽含量與粗蛋白質(zhì)含量見(jiàn)表3。

由表3可知，理論最優(yōu)條件沒(méi)有正交表中最優(yōu)組合結(jié)果好，因此最優(yōu)條件為A1B3C3D3E3，即接種量1.5％，加酶量450u／g，料水比1：1.4，溫度40℃，時(shí)間48h，發(fā)酵結(jié)束后小肽含量從11.40mg／g提高到199.65mg／g；粗蛋白質(zhì)從47.62％提高到56.72％。

2.3 SDS—PAGE電泳檢測(cè)蛋白降解程度

將最終確定的發(fā)酵工藝的發(fā)酵產(chǎn)品進(jìn)行SDS—PAGE檢測(cè)，以原料豆粕做對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)圖6。圖6結(jié)果顯示，與原豆粕相比，發(fā)酵產(chǎn)品中的大分子蛋白得到有效降解，生成小分子的多肽、小肽和氨基酸，其蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量在45kDa以下，小于14.4kDa的占很大一部份，由此可見(jiàn)，發(fā)酵后豆粕的品質(zhì)得到了有效提升。

討論

小肽的制備主要采用微生物發(fā)酵法和酶解法。從本質(zhì)上講，微生物發(fā)酵法和酶解法都是利用蛋白酶的酶解作用。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)小肽的工藝主要有固體發(fā)酵和液體發(fā)酵。微生物固體發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn)是能較好地去除豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子。發(fā)酵過(guò)程中加入的微生物如乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌等，其本身就是益生菌，有利于改善動(dòng)物胃腸道的微生態(tài)環(huán)境，減少抗生素的應(yīng)用和疾病的發(fā)生。本研究采用的是芽孢桿菌和酵母菌混合發(fā)酵豆粕，芽孢桿菌相對(duì)于霉菌來(lái)講，生長(zhǎng)速度較快，發(fā)酵周期較短，降低了生產(chǎn)成本，并且在發(fā)酵過(guò)程中分泌蛋白酶，利用蛋白酶的內(nèi)切作用將蛋白質(zhì)降解成低分子質(zhì)量的肽，因此對(duì)豆粕蛋白有較好的降解作用；酵母菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生酒香味，使發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味有所提升，同時(shí)酵母本身也是很好的菌體蛋白，使豆粕發(fā)酵后的粗蛋白質(zhì)提高。

目前酶解法制備小肽。主要采用中性蛋白酶、堿性蛋白酶和酸性蛋白酶(劉通訊，2002)。萬(wàn)琦(2003)，劉大川和鐘方旭(1996)研究了5種蛋白酶：中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶的特性，篩選出堿性蛋白酶水解大豆蛋白制大豆肽，水解效果雖然較好，但是產(chǎn)物帶有強(qiáng)烈的苦味，需要采取一定的脫苦工藝后方可使用。王之盛和況應(yīng)谷(2004)的研究結(jié)果表明，在堿性條件下有利于豆粕抗原蛋白的降解，中堿性條件有利于7S和2S小分子質(zhì)量抗原蛋白的進(jìn)一步降解。本研究采用中性蛋白酶酶解豆粕，相對(duì)于堿性蛋白酶和酸性蛋白酶，避免固體發(fā)酵pH調(diào)節(jié)困難的問(wèn)題，使發(fā)酵方式更為簡(jiǎn)單有效。

菌酶混合協(xié)同處理法生產(chǎn)小肽，充分利用微生物發(fā)酵與酶解各自的優(yōu)勢(shì)。發(fā)揮微生物與蛋白酶的協(xié)同作用使豆粕蛋白降解更充分，小肽化程度更高，同時(shí)避免了酶解產(chǎn)品的苦味，提高產(chǎn)品風(fēng)味及適口性，進(jìn)一步改善了豆粕飼用肽產(chǎn)品品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。這對(duì)實(shí)現(xiàn)飼用肽的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要的參考價(jià)值。

結(jié)論

以豆粕為原料，利用芽孢桿菌、酵母菌、中性蛋白酶混合發(fā)酵豆粕生產(chǎn)小肽飼料。在接種量1.5％、加酶量450U/g、料水比1：1.4、發(fā)酵溫度40℃、發(fā)酵時(shí)間48h條件下。豆粕發(fā)酵后，小肽含量和粗蛋白含質(zhì)量都有顯著提高，小肽含量從11.40mg／g提高到199.65mg／g；粗蛋白質(zhì)從47.62提高到56.72％。

實(shí)戰(zhàn)操作技術(shù)——棉菜籽餅脫毒變身優(yōu)質(zhì)飼料替代豆粕操作新技術(shù)

當(dāng)前豆粕價(jià)格很高有些地方貨源緊缺，而棉菜籽餅（棉籽粕、菜籽粕）價(jià)格相對(duì)便宜，棉菜籽餅是棉子、油菜籽榨油后剩下的餅狀殘?jiān)?，蛋白質(zhì)含量較高，含有各種氨基酸成分。但由于棉菜籽餅中含有植酸、芥子堿等物質(zhì)，這些物質(zhì)含有一定的毒性，還會(huì)影響動(dòng)物的消化吸收，不能大量使用，因此不建議直接飼喂給動(dòng)物！

現(xiàn)在通過(guò)微生物飼料發(fā)酵劑的除毒脫毒技術(shù)，可以成功將菜籽餅變?yōu)閮?yōu)質(zhì)添加飼料，直接按照1公斤發(fā)酵的棉菜籽餅（發(fā)酵前的重量）代替約0.85公斤豆粕進(jìn)行使用。飼料發(fā)酵劑中的有益微生物，在發(fā)酵過(guò)程中分泌的代謝產(chǎn)物，可將棉菜籽餅中的毒性物質(zhì)等有效分解。

豆粕、菜粕、棉粕成分對(duì)比

1.豆粕是一種高蛋白原料，無(wú)需脫毒即可用作飼料。其中蛋白質(zhì)含量為40%-48%，賴氨酸含量為2.5%-3.0%，色氨酸含量為0.6%-0.7%，蛋氨酸含量為0.5%-0.7%。2020年11月12日?qǐng)?bào)價(jià)每噸在3500元左右。

2.菜粕的粗蛋白含量在34%-38%之間，特點(diǎn)是蛋氨酸含量高（僅次于芝麻餅、粕），賴氨酸含量亦高。而精氨酸含量低，是餅、粕飼料中含量最低的。菜籽粕的有效能值偏低（淀粉含量低、菜籽殼難以消化利用）。礦物質(zhì)中，鈣和磷的含量均高，硒和錳的含量亦高。特別是硒的含量是常用植物飼料中最高的。2020年11月12日?qǐng)?bào)價(jià)每噸在2900元左右。

3.棉粕蛋白質(zhì)含量一般為44.32%，僅次于豆粕的蛋白質(zhì)含量48%，而高于菜籽粕的蛋白質(zhì)含量36.04%。精氨酸含量高達(dá)3.6%-3.8%，而賴氨酸含量?jī)H有1.3%-l.5%，只有豆粕的一半。2020年11月12日?qǐng)?bào)價(jià)每噸在3000元左右。

是否需要脫毒處理

1.豆粕無(wú)需經(jīng)過(guò)脫毒即可用作飼料。而且豆粕中富含蛋白質(zhì)和多種氨基酸，在不需要額外加入動(dòng)物性蛋白的情況下，僅豆粕中含有的蛋白質(zhì)和氨基酸足以平衡家禽和豬的食譜，促進(jìn)它們的營(yíng)養(yǎng)吸收。只有當(dāng)其他粕類單位蛋白成本遠(yuǎn)低于豆粕時(shí)，豆粕才有可能被替代。

2.菜粕菜籽中含有硫葡萄糖苷、芥酸、單寧、皂角苷等不良成分，其中主要是硫葡萄糖苷。硫葡萄糖苷本身無(wú)毒，但在一定溫度和水分條件下，經(jīng)過(guò)菜籽本身含有的芥子酶的酶解作用而產(chǎn)生異硫氰酸酯、唑烷硫酮和腈類等有害物質(zhì)。這些物質(zhì)可引起甲狀腺腫大，從而造成動(dòng)物生長(zhǎng)速度下降，繁殖力減退。單寧則妨礙蛋白質(zhì)的消化，降低適口性。而芥酸阻撓脂肪代謝，造成心臟脂肪蓄積及生長(zhǎng)受到抑制。。使用前需進(jìn)行一定的脫毒處理，并且使用時(shí)要加以限制，具體喂量應(yīng)根據(jù)菜粕中有害成分含量而定。經(jīng)過(guò)脫毒處理的菜籽粕喂量可以加大，而“雙低”油菜籽生產(chǎn)的菜粕喂量要受限制。同時(shí)，應(yīng)結(jié)合菜粕的氨基酸組成特點(diǎn)，適當(dāng)搭配其它餅粕。

3.棉籽中含有對(duì)動(dòng)物有害的棉酚及環(huán)丙烯脂肪酸，尤其是棉酚的危害很大。在制油過(guò)程中，由于蒸炒，壓榨等熱作用，大部分棉酚與蛋白質(zhì)、氨基酸結(jié)合而變成結(jié)合棉酚，結(jié)合棉酚在動(dòng)物消化道內(nèi)不被動(dòng)物吸收，故毒性很小。另一部分棉酚則以游離形式存在于餅、粕及油品中，這部分游離棉酚對(duì)動(dòng)物毒性較大，尤其單胃動(dòng)物過(guò)量攝取或攝取時(shí)間較長(zhǎng)，可導(dǎo)致生長(zhǎng)遲緩、繁殖性能及生產(chǎn)性能下降，甚至導(dǎo)致死亡。幼小動(dòng)物對(duì)棉酚的耐受能力更低。由于棉籽餅、粕中游離棉酚對(duì)動(dòng)物有害，因此，在使用棉餅、粕時(shí)，要根據(jù)飼喂對(duì)象及餅粕中游離棉酚的含量加以限量。反芻家畜在有優(yōu)質(zhì)粗料及多汁青料的情況下，棉籽餅、粕的用量不受限制，不會(huì)造成中毒。對(duì)單胃動(dòng)物要限制喂量，最好使用經(jīng)過(guò)脫毒處理的棉籽餅粕。同時(shí)，使用棉籽餅、粕配制飼糧要注意氨基酸平衡，尤其是棉籽餅、粕的賴氨酸含量低，且利用率差，應(yīng)注意添加賴氨酸。

發(fā)酵操作技術(shù)

發(fā)酵棉菜籽餅其實(shí)也是一個(gè)脫毒技術(shù)，具體操作如下：

1.仔細(xì)檢查棉菜籽餅，剔除棉菜籽餅中嚴(yán)重變質(zhì)發(fā)霉的部分，輕度發(fā)霉的原料可以忽略，因?yàn)槲⑸锇l(fā)酵能夠脫霉。

2.將棉菜籽餅粉碎并添加適量的玉米粉淀粉類的能量飼料等，調(diào)節(jié)飼料營(yíng)養(yǎng)比例。

3.每噸棉菜籽餅加入2公斤食鹽、玉米粉（其它淀粉、面粉次粉等也可以，或者粉碎的生紅薯300公斤也可以）100公斤、“99多功能飼料發(fā)酵劑”1包（500g/包，市場(chǎng)售價(jià)約25元，以高濃度乳酸菌、酵母菌、復(fù)合酶制劑的專業(yè)發(fā)酵劑）。

4.在混合物料中添加適量水分，使混合物料含水量保持在55%左右，以“手抓一把并緊握，無(wú)水滴落，松手后輕觸即散”為宜，一般上述配方中需要加入清水約500-600公斤。

5.發(fā)酵方式根據(jù)實(shí)際環(huán)境條件各異，在桶、缸、塑料袋等容器中發(fā)酵均可。

6.發(fā)酵時(shí)要盡可能排盡空氣進(jìn)行密封發(fā)酵。如果使用的發(fā)酵容器有密封不嚴(yán)實(shí)的隱患，要在一開(kāi)始就在其外層包裹一層塑料袋并扎緊。發(fā)酵過(guò)程中不能啟封。

7.發(fā)酵時(shí)間受環(huán)境溫度影響，通常夏季發(fā)酵2-3天，冬季發(fā)酵5-7天即可完成。發(fā)酵完成后，有較為強(qiáng)烈的酸香味，ph值在3-4。

規(guī)模運(yùn)用混合發(fā)酵現(xiàn)場(chǎng)

塑料缸、飼料袋（有內(nèi)膜）均可做發(fā)酵飼料

采用池子發(fā)酵

發(fā)酵完成的棉菜粕飼喂動(dòng)物技術(shù)

需要注意的是，發(fā)酵后的飼料酸度較低，不可以取代禽畜全部日糧。其他類發(fā)酵飼料同理。飼喂時(shí)根據(jù)不同情況，將發(fā)酵飼料按照一定比例添加到日糧中，發(fā)酵完成的棉菜粕為濕料，具體使用量每大概1.5-2公斤發(fā)酵棉菜粕（濕料）代替動(dòng)物日糧配方中1公斤豆粕的使用量進(jìn)行代替使用，與其它飼料混合后直接飼喂，由于棉菜籽粕蛋白較高，最高使用量不要超過(guò)禽畜日糧飼喂量的40%（濕料重量）。如果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵飼料過(guò)酸適口性變差，可在飼喂前在陽(yáng)光下曬1-2小時(shí)，或添加適量的碳酸氫鈉（小蘇打）即可改善。

發(fā)酵過(guò)程中與發(fā)酵后使用過(guò)程中，發(fā)酵的容器要一直保持密封狀態(tài)，可以長(zhǎng)時(shí)間保存（一年左右）。

當(dāng)前養(yǎng)殖業(yè)成本高居不下，而飼料成本是其中最高的，利用廉價(jià)原料發(fā)酵飼料（包括一些輕度發(fā)霉的粕類低價(jià)收回）是極佳解決辦法。通過(guò)微生物飼料發(fā)酵劑的發(fā)酵作用，可以將輕度霉變飼料變成優(yōu)質(zhì)飼料，將不易消化的物質(zhì)分解為可被畜禽吸收的小分子糖類、氨基酸等。同時(shí)發(fā)酵飼料中富含有益微生物、酶制劑、酸化劑等，可調(diào)節(jié)畜禽腸胃微生態(tài)環(huán)境并進(jìn)一步提高飼料利用率。發(fā)酵飼料氣味清香，提高了飼料的適口性，加上發(fā)酵飼料中有大約4℃的酒度，能夠促進(jìn)動(dòng)物新陳代謝促進(jìn)健康抵御疾病，是當(dāng)前養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中重要的一環(huán)。

本技術(shù)也可以同樣發(fā)酵菜籽粕（餅）、棕櫚粕等，方法同上。

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2020年已全面禁抗，我們之前經(jīng)常在飼料中添加的抗生素進(jìn)行促生長(zhǎng)行為將是違法，否則面臨巨額罰單。如何既能夠促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)又能夠形成無(wú)抗養(yǎng)殖呢？其實(shí)中草藥在促進(jìn)畜禽養(yǎng)殖健康和生長(zhǎng)、改善肉蛋奶品質(zhì)大有可為，特別是將中草藥發(fā)酵后效果提升4-28倍等好處，這個(gè)實(shí)施方案比你想象中效果更好，運(yùn)用的沒(méi)有不被效果折服的，值得嘗試驗(yàn)證

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